Действие игры разворачивается в недалёком будущем и прошлом, а именно в 1191 году во время Третьего крестового похода. Бармена Дезмонда Майлза, главного героя, похищает корпорация «Абстерго», которая с помощью Анимуса, машины для извлечения генетической памяти, хочет найти артефакт тамплиеров. В курс дела Дезмонда вводят учёный Уоррен Видик и его ассистентка Люси Стилман. Они рассказывают ему, что он является потомком ассасина Альтаира ибн-Ла-Ахада, который обнаружил артефакт, и через него хотят узнать местонахождение артефакта.

В прошлом, предок Дезмонда Альтаир вместе с ассасинами Маликом и Кадаром прибывают в Храм Соломона в Иерусалиме, чтобы не дать тамплиерам завладеть артефактом. В храме Альтаир встречает Робера де Сабле, магистра Ордена Тамплиеров, и ослепленный гордыней Альтаир неудачно атакует его. После неудачной попытки убийца бежит, оставив своих товарищей на растерзание тамплиерам.

Альтаир прибывает в город Масиаф, где располагается крепость ассасинов, к лидеру ассасинов Аль-Муалиму (с арабск. учитель), который был крайне разочарован провалом задания. Однако вслед за Альтаиром прибывает Малик, спасшийся из Храма, вместе с артефактом. Как выясняется Кадар погиб, а Малик привёл за собой тамплиеров в Масиаф, которые убивают жителей города. Альтаир помогает ассасинам спасти жителей и эвакуировать их в крепость. Тамплиеров привёл лично Робер, который потребовал у Аль-Муалима вернуть ему артефакт. Аль-Муалим отказался и приказал Альтаиру и Рауфу, ассасину, уничтожить тамплиеров. Альтаир совершил диверсию и отбил армию Робера. После отступления Робера Аль-Муалим отчитал Альтаира за нарушение Кредо Ассасинов в Храме Соломона и в наказание пронзил кинжалом и низвёл до самого низкого ранга. Чтобы снова вернуть доверие братства, Аль-Муалим дал задание найти предателя в Масиафе. Информатор ассасинов указал на местного глашатая Масуна. Именно он открыл ворота тамплиерам в Масиаф. В ходе допроса Масун указал на Джамаля, ассасина, который велел открыть ему ворота. Сам Масун был казнён Аль-Муалимом.

После выявления предателя Аль-Муалим приказал Альтаиру убить Тамира, торговца из Дамаска. Альтаир прибывает в Дамаск, в бюро ассасинов. Там Рафик, глава бюро, даёт разрешение на убийство Тамира. Альтаир находит Тамира на рынке, жестоко избивающего главу местного цеха, в сопровождении личной охраны. Альтаиру удаётся убить Тамира, который перед смертью ведает, что он поставляет оружие некому братству.

Альтаир снова прибывает в Масиаф, где Аль-Муалим даёт 2 новых задания: убить работорговца Талала в Иерусалиме и магистра госпитальеров Гарнье де Налуза в Акре. В Иерусалиме с помощью Малика, который стал главой бюро в Иеруслаиме, Альтаир выходит на Талала. Альтаир находит Талала, но попадает в ловушку устроенную им и его стражей. В итоге Альтаир убивает Талала, который успевает сказать, что он поставлял рабов для некого братства. В Акре, Альтаир находит Гарнье в больнице, где он ставит свои эксперименты над больными. Альтаир также уносит жизнь Гарнье, и тот признаётся, что тоже работал на тайное общество.

Альтаир прибывает в Масиаф, и Аль-Муалим говорит ему о том, что его жертвы состояли в Ордене Тамплиеров и подчинялись Роберу. Они хотят закончить войну между крестоносцами и сарацинами, и создать новое государство в Святой Земле. Но тамплиеры ещё сильны, и Аль-Муалим даёт новые имена тех, кто должен умереть: Абу-аль-Нуквод — богатый купец в Дамаске, Мадж-Аддин — регент Иерусалима и Вильям Монферрат — наместник Акры.

Альтаир проникает в Дамаск, в дворец Абу-аль-Нуквода, где тот устраивает пир для местной аристократии. Но праздненство является ловушкой, и хозяин убивает гостей. Альтаиру удаётся убить купца. Перед смертью он признался, что хотел убить сторонников Салах ад-Дина и желал передать Дамаск тамплиерам. После Дамаска Альтаир приходит в Иерусалим., где ему удаётся спасти одного ассасина и убить Мадж-Аддина. Перед смертью тот говорит о том, что хотел очистить Иерусалим от скверны, дабы он стал столицей нового государства тамплиеров на Святой земле. Позже Альтаир прибывает в Акру, где в это время находился король Англии Ричард I Львиное Сердце. Альтаир становится свидетелем ссоры Вильяма и Ричарда. Вильям отправляется в свою цитадель, где Альтаиру удаётся убить его. Перед смертью жертва признаётся, что готовил армию для свержения Ричарда и присоединения Акры к тамплиерам.

Альтаир снова прибывает в Масиаф, где Аль-Муалим показывает артефакт тамплиеров, который называет Яблоком Эдема. Оно обладает сверхъестественной силой: с его помощью Моисей раздвинул море, а Иисус превращал воду в вино и ходил по воде. Лидер ассасинов даёт Альтаиру новое задание убить Джубаира — придворного учёного египетского султана в Дамаске и Сибранта — магистра Тевтонского Ордена в Акре. В Дамаске Альтаир находит Джубаира в библиотеке, где он и его последователи сжигают все книги. Перед смертью жертва признаётся в том, что хотел освободить умы людей, так как книги лишают их возможности самостоятельно думать. Позже Альтаир отправляется в доки Акры, и попав на корабль Сибранта, убивает его. Перед смертью тот признаётся, что готовил флот для блокады Святой Земли.

После Альтаир прибывает в Масиаф. Аль-Муалим даёт последнее задание — убить Робера де Сабле. Альтаир отправляется в Иерусалим, где получает данные о том, что жертва будет присутствовать на похоронах Мадж-Аддина. Альтаир приходит на кладбище и попадает в ловушку, где с ним сталкивается сам магистр. После продолжительной драки Альтаир узнаёт о том, что вместо Сабле сражался с Марией Торп, а Робер отправился в Арсуф, чтобы заключить союз между сарацинами и крестоносцами против ассасинов. Альтаир отпускает девушку, а сам отправляется к Малику.

Убийца отправляется в Арсуф, где встречает Робера и Ричарда. Альтаир пытается доказать Ричарду, что Робер предатель, и король решает, чтобы они сразились между собой. Побеждает ассасин, и Робер раскрывает истинную суть заговора: Аль-Муалим был в сговоре с тамплиерами, но предал их, чтобы не делиться яблоком Эдема и единолично править. Он использовал братство ассасинов, чтобы уничтожить знавших об артефакте.

Альтаир срочно направляется в Масиаф, где на него нападают ассасины, разум которых помутнён яблоком. Но Малик, Рауф и другие несломленные убийцы помогают Альтаиру. Альтаир направляется в крепость, где сражается с Аль-Муалимом. В итоге духовный лидер убит, из его руки выпадает Яблоко, из которого появляется голограмма Земли с отмеченными точками, где предположительно хранятся другие частицы(яблоки) Эдема.

В будущем Дезмонд узнаёт, что «Абстерго» и Видик являются тамплиерами, а Люси — ассасином, работающим под прикрытием. Также он обнаруживает в компьютерах «Абстерго» данные о некой Лейле, работающей до Люси у Видика и об объекте 16, которого держали до Дезмонда и который оставил по всей лаборатории кровавые символы. В конце игры Видик сообщает руководству «Абстерго», что добыл координаты частиц Эдема. «Абстерго» предлагает убить Дезмонда, но Люси предлагает руководству, чтобы они его оставили в живых, так как он может обладать ещё полезной информацией. После разговора Видик и Люси уходят, а Дезмонд начинает разглядывать кровавые символы.
Первоисточник